適用于人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本   

簡介  

  PD-1 是Ｔ細(xì)胞的跨膜受體屬于免疫球蛋白 B7-CD28 家族中的一員，相對分子質(zhì)量為 55000，由胞外段、疏水性跨膜區(qū)及胞內(nèi)段三者組成，編碼基因為第 2 號染色體的 PDCD1 基因，胞內(nèi)段的酪氨酸殘基構(gòu)成了 2 個基序，即免疫受體酪氨酸抑制基序及轉(zhuǎn)換基序兩部分。PD-1 的表達主要存 在于以下細(xì)胞的膜表面：(1)絕大部分機體免疫細(xì)胞；(2)多種癌細(xì)胞。 

  現(xiàn)已證實，B7家族中的 PD-L1(CD274)和 PD-L2(CD273)是 PD-1 的 2 個配體，二者具有37%的同源序列，但表達不同。雖然 PD-L2 與 PD-1 相互作用的親和力強于 PD-L1，但 PD-L2 通常處于低表達狀態(tài)且 表達范圍局限，故目前認(rèn)為 PD-1 的主要配體為 PD-L1。

  T 細(xì)胞通過雙重信號的刺激發(fā)揮免疫效應(yīng)，在信號傳導(dǎo)過程中需要協(xié)同刺激分子的作用，而協(xié)同刺 激分子又分為正性和負(fù)性 2 種，正 常 生 理 狀 態(tài) 下 二 者 保 持 平 衡。然而，在腫瘤患者中，腫 瘤細(xì)胞會為自身打造出適合自身生長的腫瘤微環(huán)境，通過各種機制異常上調(diào)負(fù)性協(xié)同刺激分子，高表達 PD-L1，從而抑制 Ｔ 細(xì) 胞 的 活 化與增殖，并使 T 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用減弱，甚至喪失?；?此，腫瘤可躲避機體的細(xì)胞免疫作用，發(fā)生免疫逃逸，進一步出現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PD-1/PD-L1 信號 通路參與腫瘤免疫逃逸機制錯綜復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)，其可能還與誘導(dǎo) T 細(xì)胞的凋亡、促進上皮細(xì)胞間質(zhì) 化等相關(guān)。 

檢測原理  

  本實驗采用雙抗體夾心 ELISA。用抗人 PD-L1/B7-H1 單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板，加入適度稀釋的樣本和標(biāo) 準(zhǔn)品，其中的 PD-L1/B7-H1 會與其單抗結(jié)合，洗去游離成分；加入生物素化的抗人 PD-L1/B7-H1 抗體， 抗人 PD-L1/B7-H1 抗體與結(jié)合在單抗上的人 PD-L1/B7-H1 結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，洗去游離的成分；加 入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素，生物素與親合素特異性結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶結(jié)合物；加入顯色劑， 若反應(yīng)孔中有 PD-L1/B7-H1，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍色；加終止液變黃。在 450nm 下測 OD 值，PD-L1/B7-H1 濃度與 OD450 值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出標(biāo)本中 PD-L1/B7-H1 濃度。

其他實驗材料 (不提供，但可協(xié)助購買) :  

1. 酶標(biāo)儀(450nm) 

2. 高精度可調(diào)移液器及吸頭: 0.5-10, 2-20, 20-200, 200-1000μ l; 一次檢測樣品較多時，最好用多 通道移液器。

3. 自動洗板機或洗瓶 

4. 37℃溫箱 

5. 雙蒸水或去離子水

6. 坐標(biāo)紙 

7. 量筒 

注意事項  

1. 試劑盒保存在2-8℃，除復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，其它成分不可冷凍。 

2. 濃縮生物素化抗體(2a)、濃縮酶結(jié)合物(3a)裝量極少，運輸中顛簸和可能的倒置會使液體沾到管壁 或瓶蓋。使用前請離心處理以使附著于管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。

3. 為避免交叉污染請使用一次性吸頭。 

4. 終止液和顯色劑具腐蝕性，避免皮膚及粘膜直接接觸，一旦接觸到這些液體，請盡快用大量水沖洗。

5. 使用干凈的塑料容器配制洗滌液，使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。 

6. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。 

7. 不要用其它來源的試劑混合或替代該產(chǎn)品的組分，不同批號的試劑盒組份不能混用，請在有效日期 內(nèi)使用本產(chǎn)品。

8. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙復(fù)孔或三復(fù)孔，加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)孔 孵育的時間一樣。 

9. 充分混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率進行振蕩)。 

10. 避免操作過程中酶標(biāo)板干燥，干燥會使酶標(biāo)板上生物成分迅速失活，影響實驗結(jié)果。 

11. 適當(dāng)?shù)南♂寴悠?，使樣品值落在?biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，根據(jù)待測因子含量高、中、低的不同，建議采用 1:100, 1:10, 1:2稀釋樣品。如果樣品OD值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，適當(dāng)增加稀釋度并重復(fù)檢測。

12. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、操作人、移液方式、洗滌方法、孵育時間及溫度、試劑盒批次的不同均可能會導(dǎo)致 結(jié)果的差異。 

13. 此法可有效的消除可溶性受體、結(jié)合蛋白以及生物樣品中的其他因素的干擾。 

14. 不同批號試劑不可混用。