保存條件 

      本試劑盒中RNase-Free DNase I 和 DNase Buffer 置于-20 ℃保存，其余組分常溫（10~25℃）保 存 18 個月。

產(chǎn)品簡介 

      本產(chǎn)品適合于從 10~200 mg 普通植物中提取總 RNA。試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù)，提取過程中無 需使用有毒的酚氯仿抽提，整個提取過程只需 20~30 min。試劑盒采用 DNase I 膜上消化，可高效 地去除 DNA，得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern Blot、Poly A 純化，核酸保護(hù)和體外翻 譯等實驗。 

產(chǎn)品特點 

? 操作簡便：20~30 min 內(nèi)完成數(shù)個樣品的總 RNA 提取；

? 高效去除基因組 DNA：DNase I 膜上消化，高效去除 DNA； 

? 安全低毒：無需酚、氯仿等有毒試劑； 

? RNA 純度高：提取的 RNA 無雜質(zhì)殘留，適用于對純度、完整性要求很高的下游實驗。 

適用范圍 

       本產(chǎn)品適用于普通植物樣品的總 RNA 提取。 

注意事項 

   1. 第一次使用前應(yīng)在漂洗液 PRW1 中加入 4 倍體積的無水乙醇；

   2. DNase I 工作液的配制：10 μL DNase I + 60 μL DNase Buffer，輕輕吹打混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配； 

   3. 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染，經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌、汗 液及 RNase 等，可能導(dǎo)致 RNA 降解； 

   4. RNA 在裂解液 PRL 中時不會被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含 RNase 的塑 料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h，塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min，然 后用水徹底清洗、滅菌； 

   5. 配制溶液如 50%、70%乙醇應(yīng)使用 RNase-Free ddH2O（將水加入干凈的玻璃瓶中，加 DEPC 至終濃度為 0.1%(V/V)，混勻放置過夜后高壓滅菌）； 

使用方法 

   1. 樣品處理：用液氮將植物樣品研磨成細(xì)小粉末。稱取 10~200 mg 粉末至 1.5~2.0 mL 預(yù)冷的離 心管中（加裂解液前樣品不能解凍，初次使用推薦樣品量為 30~50 mg，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整用量）； 

   2. 立即加入 600 μL Buffer PRL 及 20 μL β-巰基乙醇（自備）至樣品中，高速渦旋 20~60 s 混勻 樣品，室溫靜置 5 min；

   3. 室溫下 14,000×g 離心 5 min； 

   4. 將 RNase-Free gDNA Remove Column 裝在 2 mL 收集管中，把上一步的上清液轉(zhuǎn)移至柱子 中。12,000×g 離心 1 min，棄去柱子，保留濾液；

   5. 取 0.5 倍體積無水乙醇加入濾液中，用移液槍吸打 3~5 次； 

   6. 將 RNase-Free RNA Column 裝在 2 mL 收集管中。取上一步混合液（≤750 μL）至柱子中。 12,000×g 離心 1 min； 

   7. 棄濾液，把柱子裝回收集管中。取剩余混合液至柱子，12,000×g 離心 1 min； 

   8. 棄濾液，把柱子裝回收集管中。加入 500 μL Buffer PRW，10,000×g 離心 10 s； 

   9. 棄濾液，把柱子裝回收集管中，加入 70 μL 配置好的 DNase I 溶液至柱子膜中央（DNase I 溶液：10 μL DNase I+60 μL DNase Buffer，輕輕吹打混勻）。室溫放置 15 min。

 10. 加入 500 μL Buffer PRW，室溫靜置 1 min，13,000×g 離心 1 min；

 11. 棄濾液，把柱子裝回收集管。加入 500μL Buffer PRW1（已添加指定量無水乙醇）至柱子中， 10,000×g 離心 10 s； 

 12. 重復(fù)步驟 11； 

 13. 棄濾液，把柱子裝回收集管。13,000×g 離心 2 min，開蓋置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸 附材料中殘留的漂洗液； 

注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液的殘留，可能會影響后續(xù)的 RT 等實驗。 

 14. 將柱子轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管。加入 30~100 μL RNase Free ddH2O 至吸附膜中央。室溫靜置 3 min。12,000×g 離心 1 min（柱子最小的洗脫體積是 30 μL，若 RNA 產(chǎn)量超過 30 μg，推薦 進(jìn)行第二次洗脫）棄去柱子，將洗脫的 RNA 置于-80 ℃保存。 

常見問題與解決辦法 

 Q1：柱子出現(xiàn)堵塞？ 

 A1： 

   1) 樣品用量過多。按照說明書推薦的要求適量取樣； 

   2) 樣品富含多糖多酚類物質(zhì)。處理富含多糖多酚的組織，推薦用專用試劑盒提??； 

   3) 離心溫度過低。本產(chǎn)品使用操作均在室溫下進(jìn)行。 

 Q2：提取的 RNA 出現(xiàn)降解？ 

 A2： 

   1) 樣品用量過多。影響裂解液的裂解能力，造成 RNase 未被充分抑制，導(dǎo)致 RNA 降解，建議參考 說明書推薦取樣量，若要增加樣品起始量，則后續(xù)實驗中各溶液量均要按等比例增加。對于內(nèi)源 RNase 含量較多的組織應(yīng)減少樣品量，適當(dāng)增加裂解液用量； 

   2) 樣品保存不當(dāng)。反復(fù)解凍會引起 RNA 降解，盡量使用新鮮樣品或者解凍次數(shù)不超過 2 次的樣品；

   3) 操作過程中引入 RNase 污染。請使用 RNase-Free 的工具、試劑和耗材； 

   4) 電泳過程中發(fā)生降解。使用 RNase-Free 的 Loading Buffer、瓊脂糖和電泳緩沖液等。

 Q3：RNA 得率低？ 

 A3：

   1) 樣品用量過多。樣品過量會影響裂解效果，建議按照說明書要求適量取樣； 

   2) 樣品裂解不充分。請按照說明書的要求進(jìn)行充分研磨、裂解； 

   3) 洗脫不充分。RNase Free H2O 需直接加到膜中央，并靜置 2 min 后再離心，必要時可進(jìn)行二次 洗脫以提高產(chǎn)量；

   4) 吸附柱有乙醇?xì)埩?。使?Buffer PRW1 漂洗后需要開蓋晾干吸附柱中的乙醇。 

 Q4：提取的 RNA 中有 DNA 污染？ 

 A4： 

   1) 樣品用量過多。超出試劑盒規(guī)定的樣本量影響裂解液的裂解能力可能會導(dǎo)致基因組的污染； 

   2) 次生代謝物較多。次生代謝物含量高的樣本在提取 RNA 時易出現(xiàn)基因組的污染； 

   3) 操作過程中需要進(jìn)行去除基因組 DNA 的操作，若 DNA 含量較多，可延長 DNase I 消化時間或 重復(fù)消化。